- 278
近日，清华大学药学院尹航课题组研究报道了首个CRBN介导的cGAS降解剂TH35，并探究其在溃疡性结肠炎（UC）模型中的治疗潜力，证明了cGAS靶向降解策略在安全性和有效性上相较于抑制剂的显著性优势。
环磷酸鸟苷-腺苷合成酶（Cyclic GMP-AMP Synthase，cGAS）是先天免疫系统中识别细胞质DNA的关键传感器，主要通过识别细胞内的双链DNA（dsDNA）激活免疫反应。然而，cGAS的过度激活会引发慢性炎症反应，导致自身免疫性疾病的发生和发展，如在溃疡性结肠炎（UC）中发挥重要作用。近年来，大量研究表明cGAS在UC中高度活化，抑制其激活能促进UC的缓解和恢复，也有研究表明通过基因编辑技术体内敲低cGAS可显著抑制UC的进程。因此，cGAS可作为治疗溃疡性结肠炎的潜在新兴靶点。
近年来，以蛋白降解靶向嵌合体（Proteolysis-Targeting Chimeras,PROTAC）技术为代表的靶蛋白降解技术给小分子药物开发带来了新的希望。在此背景下，尹航课题组提出基于PROTAC技术开发首个cGAS降解剂，并探究其在UC小鼠模型中的抗炎活性与机制。
在cGAS PROTAC分子的设计过程中，尹航课题组选取了对人源和鼠源cGAS均具有高亲和力的cGAS抑制剂G140作为靶蛋白配体，选择了具有优异理化性质和药代动力学特征的CRBN配体（来那度胺，沙利度胺）作为E3泛素连接酶配体。随后以cGAS与G108（与G140结构相似的类比物）的复合物共晶结构为参考，对G140与cGAS进行分子对接分析并发现G140中的甲基吡唑环和羟基乙酰基团与G108中的相应基团具有相似的空间布局，均暴露于溶剂区，表明这些基团可作为连接链附着的理想位点。随后，研究人员引入了不同长度和化学类型的连接链，包括柔性基团（如乙二醇（PEG）链、烷基链）和刚性基团（如哌嗪环、哌啶环、炔基烷基链），并合成了系列PROTAC分子（TH1至TH42）。通过评估各分子的降解活性及其对cGAS通路的抑制效果，系统探究其构效关系，最终确定具有最佳活性的候选分子TH35（图1）。
图1.新型cGAS PROTAC降解剂的设计策略
研究发现，TH35在THP-1和RAW 264.7细胞中以浓度依赖性方式有效降解cGAS，DC50值分别为0.9 ± 0.2 μM和4.6 ± 0.8 μM，最大降解率超过90%。质谱分析显示，TH35显著降低cGAS蛋白水平，且在3852个识别蛋白中，32个蛋白的表达显著下调，主要为干扰素刺激基因诱导的蛋白，表明TH35通过降解cGAS抑制I型干扰素反应。回补实验结果显示，cGAS抑制剂G140、CRBN配体来那度胺或蛋白酶体抑制剂MG132能够显著逆转TH35在THP-1细胞中的cGAS降解效应，进一步证明TH35通过CRBN依赖的泛素-蛋白酶体途径诱导cGAS降解（图2）。
图2.TH35的降解活性及降解机制的研究
cGAS作为细胞质中的DNA传感器，能够识别细胞内的双链DNA（dsDNA），并激活下游的STING-TBK1-IRF3信号级联反应，在自身免疫性疾病的发病机制中扮演着关键角色。定量质谱分析显示，TH35显著降低了HT-DNA刺激下THP-1细胞中的cGAMP生成。荧光素酶报告基因实验和Western blot分析进一步证明，TH35以剂量依赖方式抑制HT-DNA刺激的cGAS信号传导及其下游关键蛋白（如STING、TBK1和IRF3）的磷酸化。此外，TH35在TREX1敲除条件下依然能显著抑制内源性cGAS激活，且对由poly（I:C）和cGAMP刺激的IFNB表达没有显著影响，进一步证明其较佳的特异性（图3）。
图3.TH35选择性抑制dsDNA诱导cGAS通路激活的研究
进一步细胞毒性评价表明，TH35在高达60μM的浓度下对多株免疫细胞未表现出显著的细胞毒性。相比之下，作为阳性对照的G140在超过30μM的浓度下显著诱发细胞毒性。这些结果表明，TH35相较于cGAS抑制剂G140展现出更为有利的体外安全性特征，具有较低的脱靶毒性（图4）。
图4.TH35与G140细胞毒性的评价
研究评估了TH35在DSS诱导的小鼠结直肠炎（UC）模型中的治疗效果。实验结果显示，TH35在20mg/kg和50mg/kg剂量下均显著缓解了DSS引起的小鼠体重减轻，且治疗效果优于传统药物5-ASA和cGAS抑制剂G140。此外，TH35治疗显著缓解了结肠萎缩和脾肿大现象，且组织学检查显示结肠组织病理学显著改善，脾脏形态恢复接近正常，病理评分低于5-ASA和G140组。综上，TH35在自身免疫疾病小鼠模型中相较于cGAS抑制剂G140具有更优的抗炎活性（图5）。
图5.TH35体内药效评价
机制研究发现，TH35在溃疡性结肠炎（UC）小鼠模型中通过特异性降解cGAS，显著抑制其下游信号通路，减少炎症反应。Western blot分析显示，TH35治疗剂量依赖性地降低了结肠中cGAS蛋白的表达水平。与5-ASA和G140相比，TH35对cGAS表达变化无显著影响，显示其在抗炎活性方面的不同作用机制。RT-qPCR分析进一步表明，TH35显著降低了结肠中多种关键炎症细胞因子的转录水平。此外，TH35显著减少了结肠组织中中性粒细胞外陷阱（NETs）的形成，表明其在抑制NETs方面的作用优于5-ASA和G140。
图6.TH35体内抗炎机制研究
该研究成功设计并报道了首个CRBN介导的cGAS PROTAC降解剂，其在体内外抗炎活性和安全性较cGAS抑制剂具有显著性提升，为cGAS靶向降解治疗自身免疫性疾病奠定了基础。
相关研究成果以“CRBN介导的新型cGAS PROTAC降解剂的发现及其抗溃疡性结肠炎的研究”（Discovery of a Novel CRBN-Recruiting cGAS PROTAC Degrader for the Treatment of Ulcerative Colitis）为题，于2月26日发表于美国化学会的《药物化学杂志》（Journal of Medicinal Chemistry）。
尹航为论文通讯作者，清华大学药学院博士后何朋和温成铭为论文共同第一作者。清华大学药学院博士生张新宇为本课题作出重要贡献。研究得到国家自然科学基金、北京市自然科学基金、北京市卓越青年科学家项目、中国博士后科学基金和国家资助博士后研究人员计划的资助。
论文链接：
